摘要：結(jié)合生產(chǎn)實際，采用不同添加量的酵母浸出液、雞血清、NADH作為半合成培養(yǎng)基的輔料進(jìn)行Hpg-8株的培養(yǎng)，通過活菌計數(shù)及菌液OD600吸光值的測定來比較各試驗組的培養(yǎng)效果，并將所獲得的培養(yǎng)物適當(dāng)濃縮后制成油乳劑滅活疫苗免疫60日齡SPF雞進(jìn)行免疫原性的測定。最后，綜合考慮各組培養(yǎng)物的抗原濃度、單位生產(chǎn)成本及免疫原性，確定使用在半合成培養(yǎng)基中添加5%雞血清、10%酵母浸出液和0.0015%NADH的培養(yǎng)方案進(jìn)行Hpg-8株的培養(yǎng)，采用該培養(yǎng)條件所獲得的菌液的活菌數(shù)可達(dá)2.04×109CFU/mL，其免疫原性也符合中華人民共和國獸藥典對Hpg-8株制苗抗原的要求。

關(guān)鍵詞：副雞嗜血桿菌Hpg-8株　培養(yǎng)　優(yōu)化　免疫原性

雞傳染性鼻炎(Infectious Coryza,IC)是由副雞嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum,Hpg)引起的雞的一種急性上呼吸道傳染病。該病主要引起蛋雞產(chǎn)蛋率明顯下降、育成雞生長不良及淘汰率增加，并易繼發(fā)或并發(fā)其他傳染病造成更嚴(yán)重的后果，從而給養(yǎng)雞業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。目前該病在世界許多地方都有發(fā)生和流行，我國于1987年首次分離到該病的病原菌 [3,4]。預(yù)防和控制該病的發(fā)生，除了加強(qiáng)飼養(yǎng)管理外，接種雞傳染性鼻炎油乳劑滅活疫苗是當(dāng)前比較有效的手段[5,6]。該病的病原Hpg按照Page分型方法，可分為A、B、C三個血清型，我國以A型菌株的流行占主導(dǎo)地位[7,8]。

Hpg對培養(yǎng)條件要求比較苛刻，僅在含有V因子（NADH,輔酶I）或雞血清的培養(yǎng)基中生長繁殖，在普通培養(yǎng)基上不生長，其常見的培養(yǎng)基有副雞嗜血桿菌干粉、半合成培養(yǎng)基、雞血清雞肉湯和胰酪胨大豆肉湯（TSA），從疫苗的生產(chǎn)成本考慮，半合成培養(yǎng)基為最佳選擇[9]。但現(xiàn)有的采用半合成培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)工藝存在抗原濃度偏低而導(dǎo)致疫苗生產(chǎn)成本偏高的問題。本研究旨在對現(xiàn)有的雞傳染性鼻炎（A型）油乳劑滅活疫苗的制苗抗原Hpg-8株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，綜合考慮培養(yǎng)物的抗原濃度、單位生產(chǎn)成本及免疫原性，確定較合適的輔料添加量，節(jié)約疫苗抗原的生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料
    1.1.1 制苗菌株：副雞嗜血桿菌Hpg-8株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。
    1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：半合成培養(yǎng)基。
    1.1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基輔料：雞血清、酵母浸出液和NADH。
    1.1.4 試驗動物（SPF級別）：20只60日齡的SPF雞，購自新興大華農(nóng)禽蛋有限公司-SPF實驗動物中心；將其分成3組，其中對照組4只，免疫組1和免疫組2各8只。
    1.2 方法
    1.2.1 雞血清、酵母浸出液及NADH添加量的摸索  分別用不同添加量的雞血清、酵母浸出液及NADH作為半合成培養(yǎng)基的輔料進(jìn)行Hpg-8株的培養(yǎng)，通過活菌計數(shù)及菌液OD600值的測定來比較各試驗組的培養(yǎng)效果。各試驗組的輔料添加量詳見表1。

表1 各試驗組所采用的輔料添加量

1.2.2 免疫原性的測定  綜合考慮1.2.1中各組培養(yǎng)物的菌液濃度及生產(chǎn)成本，選擇其中的兩組培養(yǎng)物適當(dāng)濃縮后制成油乳劑滅活疫苗，分別免疫8只60日齡的SPF雞，每只皮下注射疫苗0.5ml。免疫30天后，對各免疫組（每組8只雞）連同條件相同的空白對照組（4只雞）的每只雞眶下竇內(nèi)注射Hpg-8培養(yǎng)物0.2ml（含8×105CFU活菌）。攻毒后14天內(nèi)，每天觀察免疫組和對照組各雞只的臨床癥狀，通過比較免疫組和對照組的攻毒保護(hù)率來評價相應(yīng)培養(yǎng)物的免疫原性。

2 結(jié)果

2.1 采用2%雞血清及不同添加量的酵母浸出液和NADH的培養(yǎng)結(jié)果

在雞血清添加量為2%的條件下，酵母浸出液添加量為10%的試驗組的活菌數(shù)和菌液OD600值均顯著高于酵母浸出液添加量為20%的試驗組（P＜0.05），詳見表2中的第1、2組試驗數(shù)據(jù)；在雞血清添加量為2%的條件下，NADH添加量為0.0015%的試驗組的活菌數(shù)和菌液OD600值均顯著高于不添加NADH的試驗組（P＜0.05），但當(dāng)NADH添加量由0.0015%提高到0.003%時，相應(yīng)試驗組的活菌數(shù)和菌液OD600值差異不顯著（P＞0.05），詳見表2中的第1、3、4組試驗數(shù)據(jù)。

表2 采用2%雞血清及不同添加量的酵母浸出液和NADH的培養(yǎng)結(jié)果

2.2 采用5%雞血清及不同添加量的酵母浸出液和NADH的培養(yǎng)結(jié)果

在雞血清添加量為5%的條件下，酵母浸出液添加量為10%的試驗組的活菌數(shù)和菌液OD600值均顯著高于酵母浸出液添加量為20%的試驗組（P＜0.05），詳見表3中的第5、6組試驗數(shù)據(jù)；在雞血清添加量為5%的條件下，NADH添加量為0.0015%的試驗組的活菌數(shù)和菌液OD600值均顯著高于不添加NADH的試驗組（P＜0.05），但當(dāng)NADH添加量由0.0015%提高到0.003%時，相應(yīng)試驗組的活菌數(shù)和菌液OD600值差異不顯著（P＞0.05），詳見表3中的第5、7、8組試驗數(shù)據(jù)。

表3 采用5%雞血清及不同添加量的酵母浸出液和NADH的培養(yǎng)結(jié)果

2.3 采用10%雞血清及不同添加量的酵母浸出液和NADH的培養(yǎng)結(jié)果

在雞血清添加量為10%的條件下，酵母浸出液添加量為10%的試驗組的活菌數(shù)和菌液OD600值均顯著高于酵母浸出液添加量為20%的試驗組（P＜0.05），詳見表4中的第9、10組試驗數(shù)據(jù)；在雞血清添加量為10%的條件下，NADH添加量為0.0015%的試驗組的活菌數(shù)和菌液OD600值均顯著高于不添加NADH的試驗組（P＜0.05），但當(dāng)NADH添加量由0.0015%提高到0.003%時，相應(yīng)試驗組的活菌數(shù)和菌液OD600值差異不顯著（P＞0.05），詳見表4中的第9、11、12組試驗數(shù)據(jù)。

表4 采用10%雞血清及不同添加量的酵母浸出液和NADH的培養(yǎng)結(jié)果

2.4 免疫原性測定結(jié)果  未免疫疫苗的對照組4只雞在攻毒后14d內(nèi)，先后出現(xiàn)典型的發(fā)病癥狀，表現(xiàn)為一側(cè)或兩側(cè)眶下竇及周圍腫脹并有流鼻涕兼/或流眼淚；而免疫組1和免疫組2的所有雞在攻毒后14d內(nèi)，均未觀察到上述發(fā)病癥狀，雞只表現(xiàn)一切正常。各免疫組和對照組的攻毒保護(hù)試驗數(shù)據(jù)詳見表5；未免疫對照組雞在Hpg-8攻毒后14d內(nèi)發(fā)病的癥狀見圖1（A、B）；免疫組1和免疫組2的雞在攻毒后14d內(nèi)無任何異常癥狀，見圖1（C、D）。

表5  第5組和第9組培養(yǎng)物的免疫原性測定結(jié)果

圖1  A、B：未免疫對照組的雞只在Hpg-8攻毒后發(fā)病的癥狀圖；C：免疫組1的雞只在Hpg-8攻毒后無異常癥狀；D：免疫組2的雞只在Hpg-8攻毒后無異常癥狀    

3 結(jié)論與討論

3.1 酵母浸出液的不同添加量對Hpg-8培養(yǎng)效果的影響  綜合分析表2、表3和表4的試驗數(shù)據(jù)，無論雞血清的添加量是2%、5%和10%，酵母浸出液的不同添加量對培養(yǎng)效果的影響規(guī)律是一致的，即添加10%酵母浸出液的培養(yǎng)效果均明顯好于添加20%酵母浸出液的培養(yǎng)效果，說明酵母浸出液并非添加得越多越好，故在實際生產(chǎn)中，一定要掌握好酵母浸出液的合適添加量。

3.2 NADH的不同添加量對Hpg-8培養(yǎng)效果的影響  綜合分析表2、表3和表4的試驗數(shù)據(jù)，無論雞血清的添加量是2%、5%和10%，NADH的不同添加量對Hpg-8培養(yǎng)效果的影響規(guī)律是一致的，即添加0.0015%的NADH的培養(yǎng)效果與不添加NADH的培養(yǎng)效果差異顯著，但隨著NADH的添加量由0.0015%增加至0.003%時，菌液濃度雖有所增加，但二者差異不顯著。實際生產(chǎn)中，考慮到NADH的售價較高，建議其添加量定為0.0015%。

3.3 雞血清的不同添加量對Hpg-8培養(yǎng)效果的影響  綜合分析表2、表3和表4的試驗數(shù)據(jù)，在酵母浸出液和NADH添加量相同的條件下，隨著雞血清添加量的增加，相應(yīng)培養(yǎng)物的活菌數(shù)及OD600吸光值均顯著提高，說明雞血清對Hpg-8的培養(yǎng)起著非常關(guān)鍵的作用，其添加量與培養(yǎng)效果呈正相關(guān)。當(dāng)雞血清添加量為5%時，活菌數(shù)可達(dá)2.04×109CFU/ml；當(dāng)雞血清添加量為10%，活菌數(shù)可達(dá)3.06×109CFU/ml，并且兩組培養(yǎng)物均具有良好的免疫原性，符合中華人民共和國獸藥典[10]對Hpg-8株制苗抗原的要求。實際生產(chǎn)中，考慮到此兩組培養(yǎng)物均需經(jīng)適當(dāng)濃縮后方可配苗，二者濃縮操作的便利性相差不遠(yuǎn)，但前者的單位抗原生產(chǎn)成本顯著低于后者，故建議雞血清的添加量定為5%比較合適。

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(來源：動物防疫一線 作者：周燕芬，銀瑩，巫月生，齊冬梅，李嘉愛，張毓金）